مقدمه

رينيت آلرژيك يكي از علائم باليني آلرژي فصلي و آلرژي شغلي مي‌باشد. گرده گياهان به عنوان يكي از مهمترين عوامل ايجاد رينيت‌هاي آلرژيك مطرح هستند (15) مطالعات قبلي نشان داده‌اند كه حدود 30%- 2 از آلرژي‌هاي بيني به آسم منتهي مي‌شوند (6). مواد متعددي با منشاء گياهي باعث ايجاد آلرژي شغلي مي‌شوند. 40% از كارگراني كه در معرض اين مواد مي‌باشند، علائم آلرژي را ظاهر مي‌نمايند. 2 تا 15% از افرادي كه از آسم رنج مي‌برند دچار آلرژي شغلي نيز مي‌باشند (4).

گياه زعفران (Corcus sativus) متعلق به خانواده زنبقمي باشد كه پرچمهاي آن به عنوان افزودني غذايي مورد استفاده قرار مي‌گيرد. زعفران در ايران، اسپانيا و مناطقي ديگر از دنيا كشت مي‌شود. مهمترين منطقه كشت زعفران در ايران، استان خراسان مي‌باشد. گرده گياه زعفران به عنوان آئروآلرژن براي افرادي كه در مناطق زعفران‌خيز زندگي مي‌كنند گزارش شده است. به عنوان مثال در گزارش‌هاي قبلي، به شيوع اپيدميك يك بيماري شبيه آنفلوآنزا در طي فصل گرده‌افشاني زعفران اشاره شده است (5، 10). آزمايشات كلينيكي نقش گرده گياه زعفران را در ايجاد آلرژي تأييد نمود (14). واكنش نسبت به آلرژنها معمولاً به عنوان واكنشهاي ايمونولوژيك به واسطه IgG در نظر گرفته مي‌شود (2). IgG اختصاصي آلرژن در سرم انسان ديده شده است، اما نقش آن در ايجاد حساسيت به آلرژنها مشخص نيست (17). روش اليزا جهت مطالعه پاسخ‌هاي هومورال در مطالعات سرواپيدميولوژيك گسترده، از كارآيي مناسبي برخوردار مي‌باشد. هدف از اين تحقيق، طراحي روش اليزا براي شناسايي زير كلاسهاي اختصاصي IgG عليه گرده زعفران در سرم انسان مي‌باشد.

مواد و روش كار

تهيه آنتي‌ژن (عصاره گرده گياه زعفران): عصاره گرده گياه زعفران با ايجاد تغييراتي در روش Harfi (8) آماده گرديد كه به طور مختصر در زير شرح داده شده است. گرده‌هاي زعفران از پرچم اين گياه در ماههاي گرده افشاني (مهر- آبان) تهيه شد. گرده‌ها به وسيله استن سرد به نسبت 1 به 10 (يك گرم در 10 سي‌سي) همراه با تكان مداوم به مدت 16 ساعت چربي‌زدايي گرديد. پس از آن استن از طريق مكش با استفاده از ارلن بوخنر و قيف مخصوص آن جدا شد. گرده‌هاي فوق، در بافر فسفات 01/0 مولار (4/7 = pH) حاوي EDTA 20 ميلي‌مولار و PMSF 1 ميلي‌مولار و به مدت 18 ساعت به هم زده شد. مخلوط به دست آمده به مدت 30 دقيقه در g 5600 سانتريفوژ و محلول رويي در برابر بافر فسفات 01/0 ميلي‌مولار به مدت 48 ساعت دياليز گرديد. بعد از اين مرحله عصاره آماده شده از فيلتر mμ22/0 عبور داده مي‌شود. تمام مراحل فوق در 4 درجه سانتي‌گراد انجام مي‌گيرد. غلظت پروتئين‌هاي عصاره گرده گياه زعفران توسط روش Bradford اندازه‌گيري شد (1).

تهيه سرم افراد: 44 نمونه سرم از زعفران‌كاران ساكن در مناطق زعفران‌خيز جنوب استان خراسان (بيرجند و قاين) كه داراي علائم باليني آلرژي به گرده زعفران بودند تهيه شدند. جهت كنترل منفي، 20 نمونه سرم نيز از داوطلبان سالم كه در مناطق كشت زعفران زندگي مي‌كردند تهيه شد.

روش الايزا: روش اليزا بر روي پليتهاي ميكروتيتر (Nunc- Covalink) انجام شد. در هر يك از چاهك‌هاي پليت‌هاي اليزا 100 ميكروليتر از عصاره گرده زعفران ريخته و به مدت يك شب در 4 درجه سانتي‌گراد قرار گرفت. غلظت پروتئيني عصاره مورد استفاده براي كوتينگ 10 ميكروگرم بر ميلي‌ليتر مي‌باشد كه در 2 بافر با pHهاي متفاوت (بافر فسفات 3 = pH و 2/8 = pH) رقيق شده بود. در مرحله بعد پليت توسط بافر شستشو دهنده (بافر فسفات، 4/7 = pH حاوي 05/0% از Tween20 و 05/0% BSA) سه مرتبه شستشو داده شد. در مرحله بعد محلول اشباع كننده (BSA 1% در بافر فسفات) به مقدار 200 ميكروليتر به هر چاهك افزوده شد و در 2 حالت متفاوت يكي در 4 درجه سانتي‌گراد به مدت يك شب و ديگري در 37 درجه سانتي‌گراد به مدت يك ساعت قرار گرفت. سپس پليت‌ها دو نوبت با بافر شستشو داده شدند و نمونه‌ها به صورت دوتايي به مقدار 100 ميكروليتر به هر چاهك در 2 وقت متفاوت 1 به 10 و 1 به 50 اضافه گرديد و پليت‌ها به مدت 2 ساعت در 37 درجه سانتي‌گراد نگهداري شد. بعد از اين مرحله و شستشوي مجدد، آنتي‌بادي موشي عليه كلاسهاي IgG انساني mouse anti human IgG1,2,3,4 (منو كلونال آنتي‌بادي، تهيه شده از شركت Sigma)، به طور مجزا به مقدار 100 ميكروليتر به هر چاهك اضافه شد و در دماي 37 درجه سانتي‌گرا به مدت 1 ساعت انكوبه گرديد.

بعد از شستشوي مجدد، محلول كونژوگه پراكسيداز- IgG (anti mouse HRP) تهيه شده از شركت sigma به ميزان 100 ميكروليتر در هر چاهك در رقتهاي متفاوت اضافه گرديد و پليتها در دماي 37 درجه سانتي‌گراد به مدت 1 ساعت قرار داده شد. در نهايت بعد از شستشو، از محلول سوبستراي آنزيم كه شامل 50 ميكروليتر TMB(3,3,5,5 Tetra Methyl Benzidine) با غلظت mg/ml 3/0 در DMSO و 5 ميلي‌ليتر بافر استات سديم 5/5= pH همراه با 1 ميكروليتر (30%) H2O2 مي‌باشد به پليتها اضافه گرديد. پليت‌ها در تاريكي و در دماي اتاق به مدت 30 دقيقه قرار داده شد. واكنش به وسيله اضافه نمودن 50 ميكروليتر HCl2 نرمال متوقف و ميزان جذب نوري نمونه در طول موج 450 نانومتر توسط دستگاه اسپكتروفتومتر مخصوص اليزا تعيين گرديد. در تمام مراحل نگهداري، سطح پليتها به وسيله پارافيلم به منظور جلوگيري از تبخير پوشانده مي‌شد.

آناليز آماري: جذب متوسط نمونه‌ها در هر سرم با جذب متوسط سرم شاهد مقايسه گرديد. جذبهاي بين نمونه‌هاي مختلف نيز به وسيله برنامه آماري SPSS با هم مقايسه شد. ميزان p با مقدار كمتر يا مساوي 05/0 معني‌دار در نظر گرفته شد. در صورتي كه ميزان جذب نوري يك نمونه بالاتر از حد cut-off (+2SD متوسط جذب نوري كنترل منفي = cut-off) بود، اين نمونه به عنوان فرد حساس به زعفران در نظر گرفته شد.

نتايج

بافرهاي كوتينگ (coating buffer)

به منظور ارزيابي بافر نگهدارنده، مقايسه بين متوسط جذبهاي خوانده شده در نمونه كنترل و نمونه‌هاي مورد آزمايش در 2 حالت مورد بررسي قرار گرفت. تفاوت بين بافر فسفات 015/0 مولار 2/8 = pH با 3 = pH در ميان 2 گروه مورد مطالعه معني‌دار بود. (شكل 1)

شرايط اشباع شدن

مقايسه بين 2 حالت اشباع شدن نشان داد كه اشباع شدن در دماي 4 درجه سانتي‌گراد به مدت يك شب مؤثرتر از اشباع شدن در دماي محيط به مدت 1 ساعت مي‌باشد (شكل 2).

رقتهاي سرم

به منظور يافتن بهترين رقت سرم، رقتهاي متفاوت 1:10 و 1:50 تعيين شد و بهترين رقت، 1:10 مشخص شد (شكل 3).

رقتهاي آنتي‌بادي

با به كار بردن رقتهاي (1:2000 – IgG4، 1:1000 – IgG3، 1:1000 – IgG2، 1:1000 از كونژوگه كمترين پس‌زمينه و بالاترين جذب را براي نمونه‌هاي حساس نشان داد (شكل 5).

بحث

در فردي كه ايمونيزه نشده و در معرض آنتي‌ژن (به عنوان مثال آئروژنها مانند علف و چمن و دانه‌ها و گرده) قرار مي‌گيرد سطح آنتي‌بادي‌هاي اختصاصي او معمولاً خيلي پايين بوده يا غير قابل اندازه‌گيري مي‌باشد. بنابراين حساسيت يك روش اندازه‌گيري كه براي سنجش اين نمونه سرمها به كار مي‌رود مهم مي‌باشد. زيرا سطح نانو گرم بر ميلي‌ليتر آنتي‌بادي IgG اختصاصي بايد در حضور سطح ميلي‌گرم بر ميلي‌ليتر IgG غيراختصاصي اندازه‌گيري شود. در مقابل افرادي كه آنتي‌ژن‌ها را به صورت تزريقي دريافت كرده‌اند مثلاً به صورت اتفاقي در معرض آن قرار گرفته باشند يا تحت ايمونوتراپي با آلرژن فعال باشند، مي‌توانند سطح بالاي ميكروگرم بر ميلي‌ليتر از IgG اختصاصي را توليد كنند. در اين سطح‌ها اتصال غيراختصاصي و حساسيت سنجش بسيار با اهميت مي‌باشد (13).

اگر چه روشهاي مختلفي مانند RIA و EIA براي سنجش كمي IgG اختصاصي آنتي‌ژن و سرم انسان طراحي شده است (17)، اين تحقيق بر روي سنجش كيفي IgG اختصاصي آنتي‌ژن در سرم انسان تمركز نموده است.

سطوح آنتي‌بادي IgG اختصاصي سرم براي تخمين در معرض قرار گرفتن شغلي به آنتي‌‌ژن‌ها، مورد ايراد قرار گرفته است و پيشنهاد شده كه به عنوان بيوماركر در معرض قرار گرفتن به آنتي‌ژن‌ها در نظر گرفته شود (3).

در مطالعات قبلي به اين اشاره شده است كه آنتي‌بادي‌هاي IgG اختصاصي عليه آئروآلرژنها (قارچها، اكتينوميست‌ها و غيره) مي‌تواند در سرم افراد نرمال تعيين گردد، اگر چه اين سطوح معمولاً پايين‌تر از بيماران آلرژيك مي‌باشد (10، 12). نتايج تحقيق حاضر اختلاف معني‌داري را بين دو گروه نشان مي‌دهد، بنابراين توصيه مي‌شود كه آئروآلرژنهاي زعفران در ليست (panel) آلرژنها محسوب گردد. زماني كه بيماران آلرژيك در معرض قرار مي‌گيرند (مخصوصاً افرادي كه در مناطق زعفران‌خيز زندگي مي‌كنند)، استفاده از آنتي‌ژن‌هاي خالص در سنجش ايمني سبب كاهش قابل ملاحظه احتمالي واكنشهاي متقاطع مي‌شود (9). در اين تحقيق آنتي‌ژن خام مورد استفاده قرار گرفت و چون گياهان داراي آلرژنهاي مشترك هستند، انتظار مي‌رود كه با آنتي‌ژن‌هاي خام واكنشهاي متقاطع از خود نشان دهند (11). در اين تحقيق روش حساسي كه مي‌تواند براي درك نقش سطوح زير كلاسهاي مختلف IgG در حالتهاي آلرژيك و رابطه آنها با تظاهرات باليني مورد استفاده قرار گيرد طراحي گرديد. اين روش مي‌تواند به عنوان روشي ساده براي رديابي تأثير ايمونوتراپي توليد آنتي‌بادي‌هاي بلوك كننده IgG را تحريك نمايد. همچنين مي‌تواند به طور كلي در جمعيت جهت مطالعات گسترده سرواپيدميولوژيك مورد استفاده قرار گيرد.

تشكر و قدرداني

از معاونت پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي مشهد به خاطر تأمين هزينه‌هاي مورد نياز و همكاري سركار خانم دكتر كرماني و آقاي اناني براي جمع‌آوري نمونه‌ها تشكر و قدرداني به عمل مي‌آيد.

References

1. Bradford M., 1976, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Anal. Biochem., 72: 248-56.

2. Burrows B., Martinez F.D., Halonen M., 1989, Association of asthma with serum IgE levels and skin test reactivity to allergens. N Engl. J. Med., 320: 271-7.

3. Edward W., 1995, IgG antibodies against moulds and actinomycets as biomarkers of exposure in the work environment. Occup Hyg., 1:247-260.

4. Brito F. F., et al. 2002, Occupational allergy in Saffron workers. Allergy, 52: 633-641.

5. Feo F., Martinez J., Galinda P. A., Cruz A., Garcia R., Guerra F., 1997, Occupational allergy in Saffron workers. Allergy, 52: 633-641.

6. Grendelmeier S. H., 2001, Pollen as the cause of allergies, Ther. Umsch., 58 5:285-91.

7. Hamilton R. G., Adkinson N. F., 1979, Solid phase radioimmunoassay for quantitation of antigen specific IgG in human serum with I-125 protein A from Staphylococcus aureus. J. Immunol., 122: 1073-1079.

8. Harfi H.A., Kwaasi A.A., Tripirneni P., Pahar R. S., Groff Lonnervig V., Al- Sedairy S. T., 1992, Characterization of antigens and allergens of date palm pollen, Allergy, 47: 535- 544.

9. Heiss S., Fischer S., Muller W. D., Weber B., 1996, Identification of a 60 Kd cross-reactive allergen in pollen and plant-derived food, J. Allergy Clin. Immunol., Nov, 985ptl: 938-47.

10. Katia M. L., Ojanen T. H., Mantyjarvi R. A., 1986, Significance of IgG subclass antibodies against environmental microbial antigens in a farming population, Clin. Allergy, 16: 459-467.

11. Martinez A., Martinez J., Palacios R., 1995, The pan allergic character of profiling, Allergy Clin. Immunol. News, 73: 85-94.

12. Pulumbo S., Di Felico G., Mari A., Bonini S., 1994, IgG subclass antibodies against parietaria judica in normal and 8 allergic subjects, Allergy., Apr, 494: 229-9.

13. Rose N. R., Friedman H., Manual of Clinical Laboratory Immunology, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1992, 112- 122.

14. Sami A., Varasteh A. R., 2000, Development of an ELISA method for detection of specific IgE to saffron pollen’s, Feiz., 13; 1-6, (In persian)

15. Solomon W. R., 1984, Aerobiology of polleniosis, J. Allergy Clin. Immunol., 585: 285-91.

16. Varasteh A. R., Rahimzadeh Oskuee M., Farid Hosseini R., Rohani M., 2000, Determination of saffron pollen allergenicity, Iranian Journal of Basic Medical Sciences, 3; 33-37 (In persian).

17. Wilson A. B., Deighton J., Lachmann P. J., Ewan P. W., 1994, A comparative study of IgG subclass antibodies in patients allergic to wasp or bee venom, Allergy, Apr, 494: 272-80.